Entendendo os dois mecanismos de endocitose
Quando você está estudando biologia celular, a primeira coisa que percebe é que fagocitose e pinocitose são frequentemente explicadas como se fossem opostos completos. Na prática, não são. Ambas são formas de endocitose, ou seja, a célula engole material do meio externo formando uma vesícula a partir da membrana plasmática. A diferença real está no tipo de material internalizado e na forma como esse processo acontece no laboratório. Fagocitose é a "comida celular". A célula envolve uma partícula sólida — uma bactéria, um detrito, uma célula morta — com projeções da membrana chamadas pseudópodes. Essa partícula fica confinada dentro de uma vesícula chamada fagossomo, que depois se funde com um lisossomo. Células como macrófagos e neutrófilos são especializadas nisso. É um processo que consome bastante energia porque envolve rearranjo do citoesqueleto de actina em larga escala.
diferença entre fagocitose e pinocitose
Pinocitose é basicamente a célula "bebendo". Ela internaliza líquido extracelular junto com solutos dissolvidos. Não há partícula sólida para ser envolvida. A membrana simplesmente invagina, forma uma pequena vesícula e ela se destaca. O nome correto mais técnico é endocitose mediada por cavéolas em muitos casos, mas pinocitose continua sendo o termo usado nos livros. É um processo constitutivo, ou seja, acontece o tempo todo em praticamente todas as células, não só em células do sistema imune. O que a maioria dos materiais didáticos não destaca é que essa distinção limpa entre os dois processos é mais útil para estudar do que para observar na prática. Quando você vai para o laboratório e tenta diferenciar fagocitose de pinocitose em cultura celular, as coisas ficam borradas. Uma mesma célula pode estar realizando ambos os processos simultaneamente em regiões diferentes da membrana. Você não vê "isto aqui é fagocitose e aquilo aqui é pinocitose" olhando pelo microscópio de fluorescência sem usar marcadores específicos.
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Uma coisa que eu descobri na prática foi que usar Dextran Fluoresceína é uma das maneiras mais diretas de acompanhar pinocitose. O dextran é um polissacarídeo que a célula internaliza por via pinocítica. Você prepara uma solução a 1 ou 2 mg/mL em meio livre de soro — o soro interfere porque tem proteínas que saturam vias endocíticas alternativas — eIncuba as células por 15 a 30 minutos a 37°C. Depois lava com PBS frio. Se quiser bloquear a via, usa-se Methyl--cyclodextrin para perturbar os lipid raft antes da incubação com o Dextran. Isso normalmente reduz a internalização em cerca de 60 a 80% dependendo do tipo celular. A fagocitose, por outro lado, dá para rastrear com partículas de látex marcadas ou leveduras opsonizadas com soro fetal bovino. Mas atenção: se as partículas não estiverem corretamente opsonizadas, muitos fagócitos simplesmente não respondem. Eu perdi dois dias testando partículas de látex de 1 µm que não estavam ativadas quimicamente e as células não engoliam nada. A correção foi tratar as partículas com ácido nítrico diluído para gerar grupos carboxila na superfície antes de ressuspendê-las no meio. Depois disso a taxa de fagocitose subiu para algo em torno de 40 a 60% das células em menos de 20 minutos. Outro ponto que os iniciantes costumam perder é a questão do tamanho. Fagocitose internaliza partículas tipicamente acima de 0,5 µm, muitas vezes bem maiores que isso. Pinocitose lida com moléculas menores que ficam dissolvidas no fluido. Se você colocar nanopartículas de ouro de 20 nm, o processo dominante será pinocítico, não fagocítico, mesmo que as partículas sejam suficientemente abundantes para parecer uma "comida". O caminho de sinalização é diferente, a cinética também. Fagocitose tem uma fase de reconhecimento, acomodação da partícula e fecho da vesícula que pode levar de 2 a 10 minutos por partícula. Pinocitose é mais rápida em termos de formação de vesícula individual, mas cada vesícula carrega uma carga muito menor.
A dificuldade prática mais comum é que ambos os processos são bloqueados por baixa temperatura. Se você mantiver as células a 4°C durante o experimento, tanto a fagocitose quanto a pinocitose param. Isso serve como controle negativo útil, mas também significa que qualquer variação na viabilidade celular afeta os dois de forma similar. Se o seu tratamento tóxico matar 30% das células, você não vai conseguir distinguir se a redução no sinal de endocitose é por toxicidade direta ou por efeito específico sobre uma via. O ideal é sempre incluir um teste de viabilidade paralelo, tipo Azul Tripano ou MTT, no mesmo lote de células usadas no ensaio de internalização. Um detalhe técnico que poucos mencionam: a inibição com Cytochalasin D bloqueia a fagocitose de forma eficiente porque despolimeriza filamentos de actina. Mas em concentrações altas ou com tempo de exposição prolongado, a pinocitose também pode ser comprometida, já que cavéolas e microvilosidades dependem parcialmente do citoesqueleto para sua estabilidade. Uma concentração de 5 µM por 30 minutos geralmente bloqueia fagocitose sem afetar significativamente a pinocitose em macrófagos J774. Acima disso, o efeito passa a ser inespecífico. Se precisar confirmar especificidade, use nystatina ou Filipina para bloquear endocitose mediada por caveolina e compare com o tratamento de referência.
Para resolver problemas de alta variabilidade entre replicados, o que funciona na prática é padronizar a densidade celular no momento da incubação com o traçador. Se as células estiverem muito conglomeradas, a internalização parece maior simplesmente porque há mais área de membrana exposta ao meio com o marcação por unidade de volume. O ideal é trabalhar com cerca de 50 a 70% de confluência e usar contagem em câmara de Neubauer antes de semear. Com essa padronização, a variabilidade entre replicados técnicos costuma cair de coeficientes de variação na casa dos 25% para algo em torno de 8 a 12%, que é aceitável para ensaios de endocitose em cultura.
